Chức năng chính của ruột non là tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng. Khoảng 90% quá trình tiêu hóa và hấp thụ thức ăn diễn ra ở ruột non, trong khi phần còn lại diễn ra ở ruột già.
Ruột non được tạo thành từ một số phần gọi là tá tràng, hỗng tràng và hồi tràng. Tá tràng là phần đầu tiên; ở đây, thức ăn được đưa từ dạ dày vào ruột non. Tuyến tụy tiết dịch tiêu hóa vào tá tràng, dịch này phân hủy hầu hết các vật liệu trong ruột non. Túi mật cũng giải phóng mật vào tá tràng và rất quan trọng để phân hủy chất béo.
Thức ăn được chuyển xuống ruột thông qua nhu động, bao gồm các cơn co thắt nhịp nhàng khiến thức ăn bị ép xuống đường tiêu hóa. Các sợi cực nhỏ bao phủ các bức tường của ruột non, được gọi là vi nhung mao. Những chỗ lồi này làm tăng diện tích bề mặt của ruột non. Mỗi vi nhung mao chứa một mao mạch, do đó thúc đẩy quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng vào máu.
Ruột non cũng rất quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch. Hệ thực vật probiotic phát triển bên trong ruột non góp phần vào hệ thống miễn dịch của vật chủ. Ở người, ruột non dài khoảng 19 feet. Những chất không thể tiêu hóa được ở ruột non sẽ chuyển xuống ruột già.