Bước khử màu là bước quan trọng nhất trong quá trình nhuộm Gram. Kết quả trong bước này dựa trên mức độ dễ dàng của tế bào giải phóng phức tinh thể tím-iốt.
Được phát hiện bởi Tiến sĩ Hans Christian Gram vào năm 1884, vết bẩn Gram là một loại vết bẩn phân biệt được sử dụng để xác định vi khuẩn. Phân chia tế bào vi khuẩn thành hai nhóm chính (Gram dương và Gram âm), đây là một công cụ quan trọng khi phân loại và phân biệt vi khuẩn. Hai vết bẩn được yêu cầu là vết chính và lớp phủ. Khử màu quá mức làm cho vết chính biến mất, và Gram dương xuất hiện Gram âm. Mặt khác, khử màu quá kỹ không loại bỏ được phức hợp i-ốt tinh thể, khiến vi khuẩn Gram âm có vẻ dương tính.
