Sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm bao gồm độ dày của thành tế bào, dày khoảng 20 đến 30 nanomet ở Gram dương và 8 đến 12 nanomet ở Gram âm; số lượng peptidoglycan trong thành tế bào; và hàm lượng lipid và lipoprotein, thấp ở vi khuẩn Gram dương và cao ở vi khuẩn Gram âm. Sử dụng quy trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương cho kết quả màu tím, trong khi Gram âm cho kết quả màu hồng.
Tất cả các vi khuẩn đều chứa một lớp peptidoglycan trong thành tế bào của chúng, nhưng sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm là vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglycan mỏng nằm giữa hai lớp lipid. Đây là nguyên nhân tạo cho vi khuẩn Gram dương một vết màu hồng hoặc đỏ trong quá trình nhuộm Gram. Mặt khác, vi khuẩn Gram dương tạo ra màu tím hoặc tím do lớp peptidoglycan dày nằm trong thành tế bào của chúng. Quá trình nhuộm Gram, do Hans Christian Gram phát hiện, giúp xác định vi khuẩn.
Một điểm khác biệt khác giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm là trong cấu trúc của trùng roi, với vi khuẩn Gram dương chứa hai vòng ở thể cơ bản và vi khuẩn Gram âm chứa bốn vòng ở thể cơ bản. Vi khuẩn Gram dương có tính nhạy cảm cao với các phương pháp điều trị bằng penicillin và sulfonamide, trong khi vi khuẩn Gram âm có độ nhạy thấp.
