Gia đình của Louis Pasteur bao gồm cha mẹ ông, một anh trai, ba chị em gái, vợ, một con trai và bốn con gái. Trong số các con của ông, chỉ có hai người trưởng thành và ba người còn lại chết vì sốt phát ban khi bọn trẻ. Cha anh là một thợ thuộc da theo truyền thống lâu đời của gia đình.
Pasteur rời gia đình để đến Paris học ở tuổi 16. Tuy nhiên, vượt qua nỗi nhớ nhà, chưa đầy một tháng sau, ông đã trở về nhà để học tập tại địa phương. Sau khi hoàn thành bằng tiến sĩ năm 1847 tại Ecole Normale ở Paris, ông trở thành giáo sư tại Đại học Strasbourg vào năm 1848. Tại đây, ông gặp Marie Laurent, con gái của hiệu trưởng trường đại học và họ kết hôn vào ngày 29 tháng 5 năm 1849.
Các con của Pasteur bao gồm Jeanne, Jean-Baptiste, Cecile, Marie-Louise và Camille. Jeanne qua đời ở tuổi 9, Cecile ở tuổi 12 và Camille ở tuổi 2. Jean-Baptiste Pasteur kết hôn với Jeanne Boutroux năm 1874. Con gái Marie-Louise kết hôn với Rene Vallery-Radot năm 1879, và ông đã viết một trong những tiểu sử của Pasteur.
Mặc dù ông phải chịu bi kịch cá nhân trong gia đình mình, công việc của Pasteur đã đặt nền tảng cho việc chủng ngừa thời thơ ấu đã cứu sống nhiều trẻ em. Năm 1879, ông đã phát triển một loại vắc-xin phòng bệnh dịch tả gà. Năm 1885, ông tiêm vắc xin cho Joseph Meister, một cậu bé bị chó dại cắn. Chính thành công của loại vắc-xin này đã mang lại cho anh ấy sự nổi tiếng ngay lập tức.
