Các phản ứng độc lập với ánh sáng của quang hợp, được gọi là phản ứng tối, sử dụng ATP và NADPH được tạo ra trong các phản ứng ánh sáng để tổng hợp tiền chất đường. Trong kịch bản phổ biến nhất, được gọi là Chu trình Calvin, carbon dioxide được kết hợp vào một hợp chất ba carbon ổn định được gọi là phosphoglycerate (PGAL), đóng vai trò như tiền chất của glucose và các loại đường khác. Sáu vòng của Chu trình Calvin tạo ra tương đương của một phân tử glucose.
Các nhà sinh học chia thực vật thành ba loại gọi là C3, C4 và CAM, dựa trên cơ chế và vị trí của các phản ứng tối của quá trình quang hợp. Hầu hết thực vật được ký hiệu là C3, có nghĩa là hợp chất ổn định đầu tiên mà chúng tạo ra trong phản ứng tối là PGAL. Con đường này là tối ưu cho thực vật sống trong môi trường ôn hòa với độ ẩm và carbon dioxide dồi dào. Ví dụ về thực vật C3 bao gồm lúa mì, gạo, yến mạch và cà chua.
Ngược lại, thực vật C4 có xu hướng sống trong môi trường nóng hơn, khô hơn. Ví dụ như ngô, mía và lúa miến. Để giảm thiểu sự mất nước, thực vật C4 có cấu trúc chuyên biệt gọi là cấu trúc giải phẫu Kranz, trong đó quá trình quang hợp diễn ra trong các tế bào được sắp xếp như một lớp bao hoa hoặc bó. Thực vật C4 kết hợp carbon dioxide với phosphoenolpyruvate để tạo thành OAA (oxaloacetate). OAA được chuyển đổi thành malate, khuếch tán vào các tế bào vỏ bọc và giải phóng carbon dioxide, nhanh chóng đi vào Chu trình Calvin. Bằng cách tập trung carbon dioxide ở lớp tế bào trong cùng của cây, lượng nước bị mất đi do thoát hơi nước sẽ ít hơn.
Cuối cùng, một số loài thực vật sa mạc như xương rồng và cây thùa đã phát triển một hình thức quang hợp gọi là CAM, viết tắt của Crassulacean Acid Metabolism. Những thực vật này phải tiết kiệm nước thậm chí còn hiệu quả hơn thực vật C4. Thay vì giữ cho các khí khổng (tế bào lỗ) mở vào ban ngày như thực vật C3 và C4, thực vật CAM mở chúng vào ban đêm để tích lũy carbon dioxide, chúng dự trữ dưới dạng malate hoặc aspartate trong không bào nội bào. Vào ban ngày, thực vật khai thác các nguồn dự trữ carbon dioxide này, chuyển CO2 vào Chu trình Calvin mà không làm mất bất kỳ nước nào ra môi trường. Điều này giải thích tại sao lục lạp của xương rồng được tìm thấy trong thân cây hơn là trong lá. Chu kỳ CAM cũng giải thích cho khả năng của các chất xerophytes (thực vật sa mạc) có thể tồn tại trong nhiều tháng hoặc nhiều năm mà không có mưa.
