Nhược điểm của kính hiển vi ánh sáng bao gồm độ phân giải hạn chế, độ phóng đại thấp hơn và hình ảnh bề mặt của mẫu vật kém hơn. Kính hiển vi ánh sáng phức hợp yêu cầu người dùng điều chỉnh để đảo ngược quang học, có nghĩa là mẫu vật sẽ có vẻ bị dịch chuyển theo hướng ngược lại với hướng di chuyển của nó.
Ánh sáng nhìn thấy hạn chế độ phân giải đạt được bằng kính hiển vi ánh sáng. Độ phóng đại có thể nằm trong khoảng từ 500x đến 1500x, nhỏ hơn nhiều so với kính hiển vi điện tử; chúng cho độ phóng đại từ 160.000x trở lên. Nói chung, kính hiển vi ánh sáng yêu cầu mẫu vật phải mỏng, nhỏ và trong suốt để có thể quan sát tối ưu. Sự phát triển của kính hiển vi điện tử vào những năm 1930 đã cho phép các nhà khoa học tự do hơn trong việc xem các chi tiết nhỏ của cấu trúc tế bào.
