Tuyên ngôn Độc lập được ký bởi 56 người. Mặc dù John Hancock, chủ tịch của Quốc hội Lục địa, đã ký văn bản vào ngày 4 tháng 7 năm 1776, hầu hết các đại biểu có lẽ đã thêm chữ ký của họ vào tháng 8 . 2, 1776. Người ký cuối cùng đã thêm tên của mình vào ngày 4 tháng 11 năm 1776.
Việc ký kết Tuyên ngôn Độc lập là một cử chỉ mang tính biểu tượng, vì nó đã trở thành chính thức thông qua cuộc bỏ phiếu của quốc hội. Chữ ký của John Hancock không chỉ là chữ ký đầu tiên mà còn là chữ ký lớn nhất. Nó mang tính biểu tượng đến nỗi tên của ông đã trở thành đồng nghĩa với từ "chữ ký". Các nhà sử học không đồng ý về việc hầu hết các đại biểu ký vào ngày 4 tháng 7 hay ngày 2 tháng 8. Tuy nhiên, một số đại biểu phải ký muộn hơn ngày 4 tháng 7 vì họ tham gia Quốc hội sau ngày 4 tháng 7 thông qua văn kiện. Người cuối cùng ký là Matthew Thornton ở New Hampshire, người đã tham gia Quốc hội Lục địa vào tháng 11 năm 1776, và ký ở góc dưới bên phải của tài liệu. Người ký tên trẻ nhất là Edward Rutledge, 26 tuổi và người lớn tuổi nhất là Benjamin Franklin, 70 tuổi.
Không phải tất cả các đại biểu của Quốc hội Lục địa lần thứ hai đều ký vào Tuyên ngôn Độc lập. Một số đã bỏ phiếu chống lại nó, trong khi những người khác đã bỏ đi khi tài liệu đang được ký. Phiên bản đầu tiên được gửi đến các bang không bao gồm tất cả 56 chữ ký, nhưng vào ngày 18 tháng 1 năm 1777, Quốc hội đã yêu cầu một phiên bản khác bao gồm các chữ ký phải được phân phối cho 13 bang.
