Một số thành phố quan trọng trên bản đồ của Sông Ohio là Pittsburgh, Pennsylvania; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, Tây Virginia; và Evansville, Indiana. Những địa điểm đáng chú ý khác dọc theo sông Ohio là các thành phố Tây Virginia của Parkersburg, Wheeling và Weirton, cũng như thành phố Kentucky của Owensboro.
Sông Ohio bắt đầu ở Pittsburgh. Từ đó, sông chảy về phía bắc bởi các thị trấn Sewickley, Coraopolis, Ambridge và Aliquippa của Pennsylvania. Tại thị trấn Rochester, sông Ohio quay về hướng Tây. Sau đó, sông đi qua các thị trấn Beaver và Midland trước khi đến biên giới của Pennsylvania với bang Ohio.
Khi đi qua thành phố Ohio của Đông Liverpool, sông rẽ về phía nam. Tuyến sông xác định biên giới của Ohio với Tây Virginia. Các thành phố bên bờ sông Ohio bao gồm Steubenville, Martins Ferry, Marietta và Gallipolis. Các thành phố ở phía Tây Virginia của sông bao gồm Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant và Huntington.
Xung quanh thành phố Ironton của Ohio, sông Ohio bắt đầu xác định biên giới giữa các bang Ohio và Kentucky. Một số thành phố Kentucky qua biên giới từ Ohio bao gồm Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville và Newport. Sau khi sông đi qua Cincinnati, sông bắt đầu xác định biên giới của Kentucky với Indiana. Sau khi đi qua thị trấn Mount Wilson của Indiana, sông Ohio xác định biên giới của Kentucky với Illinois. Sông Ohio đổ ra sông Mississippi tại Cairo, Illinois.
